? ? ? ?血腦屏障是位于血液和腦脊液、血液和腦細(xì)胞之間，由腦毛細(xì)血管壁、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等形成的天然屏障。由于血腦屏障主要由內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接形成，大多數(shù)大分子物質(zhì)（包括蛋白類藥物）無法穿越，因此這類物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的效率受到嚴(yán)重限制。傳統(tǒng)的針對CNS的給藥方式，包括顱內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、腦室內(nèi)給藥和化學(xué)破壞血腦屏障給藥等，具有侵入性，可能對腦組織造成損傷，不利于重復(fù)給藥。腦組織暴露不足和給藥方式的限制，使許多針對CNS的抗體藥物無法發(fā)揮應(yīng)有的藥效。 ? ? ? ?近日，來自Denali Therapeutics Inc.的科學(xué)家在《Science Translational Medicine》上介紹了他們設(shè)計的雙特異性抗體，稱之為血腦屏障運(yùn)輸工具抗體（antibody transport vehicle，ATV）。這種抗體被認(rèn)為可特異性地與大腦內(nèi)皮細(xì)胞表面上表達(dá)的RMT受體結(jié)合，利用受體介導(dǎo)的胞吞效應(yīng)（receptor-mediated transcytosis，RMT）穿過血腦屏障，極大地提高抗體藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳遞效率。
ATV靶點的選擇 ? ? ? ?這項研究中選擇了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）作為穿越血腦屏障的靶點。TfR在腦內(nèi)皮細(xì)胞上高度表達(dá)，是重要的配體非依賴性胞吞的受體，早期動物模型實驗結(jié)果顯示，與TfR單價結(jié)合的低親和力的抗體可以提高大腦對藥物的攝取能力。大腦和腦脊液中的β淀粉樣蛋白（β-secretase 1，BACE1）可作為阿爾茲海默癥的生物標(biāo)志物，前期數(shù)據(jù)表明抗BACE1抗體可減少小鼠大腦中β淀粉樣蛋白的含量，因此研究人員選擇了BACE1作為ATV的治療靶點。 ATV的構(gòu)建和親和力改造 ? ? ? ?研究人員在人IgG1的Fc端選取了一段既遠(yuǎn)離FcRn和Fc?R結(jié)合位點又適合作為新的抗原結(jié)合位點的9個氨基酸組成的序列（圖1A）。對這個序列進(jìn)行隨機(jī)化重組，然后利用酵母展示技術(shù)和流式細(xì)胞分選技術(shù)，篩選出了四個與hTfR胞外段結(jié)合的Fc蛋白（圖1B）。將這四個Fc蛋白與抗BACE1的Fab融合構(gòu)建出ATV:BACE1重組抗體。這些ATV:BACE1抗體在蛋白水平（圖1C，ELISA）和細(xì)胞水平（圖1D，免疫熒光染色）都能與hTfR結(jié)合。最后在這四個重組抗體的基礎(chǔ)上，通過文庫篩選獲得了親和力較高且能與食蟹猴TfR（cTfR）結(jié)合的一系列ATV:BACE1抗體（圖2）用于后續(xù)體內(nèi)外功能驗證。 圖1，A野生型Fc同源二聚體蛋白結(jié)構(gòu)模型，橙色部位為篩選的9個氨基酸所處位置；B，篩選得出的4個Fc序列（TV）；C，ATV:BACE1重組抗體與hTfR蛋白的結(jié)合能力；D，ATVc:BACE1與HEK293細(xì)胞（表達(dá)TfR，不表達(dá)BACE1）的結(jié)合能力。 圖2：不同ATV:BACE1克隆對人TfR、食蟹猴TfR的親和力。 ATV:BACE1在細(xì)胞水平上的內(nèi)化 ? ? ? ?研究人員使用knob-in-hole技術(shù)合成了Fc上具有TfR單個結(jié)合位點的ATV:BACE1異源二聚體（圖3A）。將ATV:BACE1異源二聚體與HEK293細(xì)胞（表達(dá)TfR）或CHO細(xì)胞（不表達(dá)TfR）在37℃共孵育30 min后，使用抗人IgG熒光染料染色，觀察到HEK293細(xì)胞內(nèi)化的熒光標(biāo)記數(shù)與ATV:BACE1濃度呈劑量依賴效應(yīng)（圖3B），而與ATV:BACE1共孵育的CHO細(xì)胞及與Anti-BACE1共孵育的HEK293細(xì)胞均無熒光標(biāo)記（圖3B）。通過對內(nèi)化的TfR熒光染色，顯示約有50%的ATV:BACE1與TfR定位在細(xì)胞內(nèi)相同的位置。這些結(jié)果表明ATV:BACE1在細(xì)胞上的內(nèi)化依賴于TfR，且ATV:BACE1與TfR的結(jié)合不影響TfR的內(nèi)化。 圖3：A，knob-in-hole型ATV:BACE1異源二聚體的結(jié)構(gòu)；B，HEK293及CHO細(xì)胞中ATV:BACE1的染色；C，HEK293細(xì)胞中anti-BACE1的染色；D，HEK293細(xì)胞中ATV:BACE1與TfR的共染色。 雙特異性ATV在細(xì)胞水平上的療效 ? ? ? ?為了使ATV發(fā)揮更好的神經(jīng)退行性疾病療效，研究人員將針對兩個直接與阿爾茲海默癥形成有關(guān)靶點（β-secretase、Tau蛋白）的片段與ATV融合，制備了ATV:BACE1/Tau雙特異性抗體（圖4A），這種雙特異性抗體可以同時與BACE1、Tau、hTfR三個靶點結(jié)合（圖4B）。與同型對照IgG和anti-Tau抗體相比，ATV:BACE1/Tau雙特異性抗體減少了50%人初級皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中Aβ-secretase 40的數(shù)量（圖4C）。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的實驗結(jié)果顯示，預(yù)先接種Tau蛋白的HEK293細(xì)胞經(jīng)ATV:BACE1/Tau處理后能有效降低細(xì)胞中Tau蛋白的聚集（圖4D）。這些結(jié)果表明ATV:BACE1/Tau在細(xì)胞水平上具有良好的生物治療活性。 圖4：A，ATV:BACE1/Tau雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)；B，ATV:BACE1/Tau與BACE1、Tau、hTfR結(jié)合的生物干涉結(jié)果；C，ATV:BACE1/Tau處理后人神經(jīng)細(xì)胞中Aβ40的含量；D，顯ATV:BACE1/Tau處理后預(yù)先接種Tau蛋白的HEK293細(xì)胞中Tau蛋白的聚集情況（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）。 ATV:BACE1在嚙齒類及非人靈長類動物模型上的療效 ? ? ? ?TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠和食蟹猴模型中，ATV:BACE1表現(xiàn)出與親和力正相關(guān)的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)與生物清除效率（圖5C，D，圖6A）。TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠單次給藥24小時后（50mg/kg），與anti-BACE1治療組小鼠相比，ATV:BACE1治療組小鼠增加了40倍的藥物腦部暴露率（圖5A），同時可減少57%腦部可溶性Aβ40的含量（圖5B）。共聚焦顯微鏡下大腦皮層染色結(jié)果進(jìn)一步表明ATV:BACE1給藥組小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞中有顯著的藥物吸收（圖5G，H）。單次給藥后，腦部藥物暴露率的增強(qiáng)可持續(xù)7天以上，持續(xù)維持腦部較低水平可溶性Aβ40含量（圖5E，F(xiàn)）。食蟹猴模型實驗結(jié)果顯示，在靜脈單次給藥（30 mg/kg）48h后，ATV:BACE1治療組食蟹猴在尾狀核、小腦、腦皮層、海馬區(qū)、丘腦等腦區(qū)ATV:BACE1治療組藥物濃度較control IgG對照組及anti-BACE1組均有顯著增加（圖6C），且這些區(qū)域內(nèi)可溶性淀粉樣前體蛋白β的含量減少了32%-69%（圖6D）。以上實驗結(jié)果在動物模型上證明了ATV:BACE1具有良好的穿越血腦屏障能力，以及治療阿爾茲海默癥等神經(jīng)退行性疾病的潛在效果。 圖5：A，TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠單次給藥24h后腦部hIgG的濃度；B，TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠單次給藥24h后腦部Aβ40的數(shù)量；C，TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠血清中藥物PK數(shù)據(jù)（0-7天）；D，TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠腦部藥物PK數(shù)據(jù)（0-7天）；G、H，共聚焦顯微鏡TfRmu/hu轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)免疫熒光染色結(jié)果。 圖6：A，ATV:BACE1在食蟹猴血清中PK數(shù)據(jù)；B，ATV:BACE1治療后Aβ40在食蟹猴血漿中PD數(shù)據(jù)；C，ATV:BACE1在食蟹猴尾狀核、小腦、腦皮層、海馬區(qū)、丘腦等腦區(qū)的濃度；D，ATV:BACE1治療后食蟹猴尾狀核、小腦、腦皮層、海馬區(qū)、丘腦等腦區(qū)APPβ的含量。 ? ? ? ?盡管過去30年間抗體藥物已在癌癥以及自身免疫疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮至關(guān)重要的作用，在神經(jīng)退行性疾病治療上的應(yīng)用卻止步不前。如何增強(qiáng)抗體藥物腦部的吸收效率是該領(lǐng)域的痛點。該文通過構(gòu)建具有RMT受體結(jié)合位點的雙特異性抗體為增強(qiáng)抗體藥物腦部暴露率提供了新思路，相信未來這一理念有望解決神經(jīng)退行性疾病治療的難題。 ? ? ? ?原創(chuàng)內(nèi)容未經(jīng)授權(quán)，禁止轉(zhuǎn)載至其他平臺。
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